研究開発

私たちが取り組んでいる研究開発の一部をご紹介します

●ハイドロゲルビーズによる流路を持つスフェロイドの開発

　細胞を三次元的に培養する事で、平面培養と比べて生体に近い反応を得る事が期待されている

しかし、例えばスフェロイドの場合、通常細胞のみで凝集するため、スフェロイド内部における物質交換効率が低下し、

中心部に近い細胞ほど壊死し易いとされている

　ここで、我々はメチルセルロース(MC)法により、

細胞とハイドロゲルビーズを1対1で混合した

流路を持つスフェロイドの開発を進め製作することに成功した

　流路の有効性を確かめるため、ヒト肝細胞癌細胞株(Huh-7)と

ハイドロゲルビーズを用いたスフェロイドを作製し、薬剤応答性の評価を実施した

■薬剤応答性評価1

【方法】

・MC法により、細胞だけのスフェロイドと、細胞とハイドロゲルビーズの混合比を1：1に調整したハイドロゲルビーズ入り

　スフェロイドを作製

・それぞれのスフェロイドを容器に入れ、薬剤に暴露

・1日後、LIVE/DEAD染色を実施し、共焦点顕微鏡による画像から、画像処理を用いて定量化

【条件】

・薬剤暴露条件

　①フルタミド　600µM

　②マイトマイシンC　100µM

・スフェロイド構成

　・使用細胞：ヒト肝細胞癌細胞株　Huh-7

　・細胞数とビーズ数

　　・ビーズ無スフェロイド：細胞数2000

　　・ビーズ有スフェロイド：細胞数/ビーズ数2000

【結果】

・ビーズ無しスフェロイドと比較し、

　ビーズ有りスフェロイドで高い死細胞率の値を示した

　(フルタミドで約30%、マイトマイシンCで約10%)

・フルタミドに於いて統計的な有意差が見られた

■薬剤応答性評価2

【方法】

・MC法により、細胞だけのスフェロイドと、細胞とハイドロゲルビーズの混合比を1：1に調整したハイドロゲルビーズ入り

　スフェロイドを作製

・それぞれのスフェロイドを容器に入れ、薬剤に暴露

・1日後、培地の上清を採取してLDH測定を実施

【条件】

・薬剤暴露条件

　・マイトマイシンC　0、10、100(µM)

・スフェロイド構成

　・使用細胞：ヒト肝細胞癌細胞株　Huh-7

　・細胞数とビーズ数

　　・ビーズ無しスフェロイド：細胞数2000

　　・ビーズ有りスフェロイド：細胞数/ビーズ数2000

【結果】

・ビーズ無しスフェロイドと比較し、

　ビーズ有りスフェロイドで高い死細胞率の値を示した(＠100µM時)

・統計的な有意差が見られた(＠100µM時)

尚、本開発成果は、日本動物実験代替法学会　第34回大会に於いて大会長特別賞を受賞

●メチルセルロース(MC)法の応用による、新たな立体凝集体の開発Ⅰ

■メチルセルロース(MC)へ一定のピッチで吐出

【方法】

MCへの打ち込みピッチを凡そスフェロイド直径の2倍程度とし、

吐出を行った

【結果】

時間経過と共に隣り合うスフェロイドが融合し、

ファイバー形状の細胞凝集体の製作に成功

●メチルセルロース(MC)法の応用による、新たな立体凝集体の開発Ⅱ

■メチルセルロース(MC)への吐出パラメータを調整

【方法】

MCへの吐出パラメータを調整

【結果】

吐出パラメータを調整する事で、スフェロイド（球体）とは異なるリング形状の細胞凝集体の製作に成功

このリング形状とスフェロイドにつき、培養毎のDNA濃度を測定したところ、培養日数14日で有意差を確認した